Інтэрферэнцыйныя фактары ў рэакцыях ПЦР

Падчас рэакцыі ПЦР часта сустракаюцца некаторыя фактары, якія перашкаджаюць.
З-за вельмі высокай адчувальнасці ПЦР кантамінацыя лічыцца адным з найбольш важных фактараў, якія ўплываюць на вынікі ПЦР, і можа прывесці да ілжывых станоўчых вынікаў.
Не менш крытычнымі з'яўляюцца розныя крыніцы, якія прыводзяць да ложноотріцательных вынікаў. Калі адна або некалькі істотных частак сумесі ПЦР або сама рэакцыя ампліфікацыі інгібіруюцца або ўмешваюцца ў яе, дыягнастычны аналіз можа быць перашкоджаны. Гэта можа прывесці да зніжэння эфектыўнасці і нават да ложноотріцательных вынікаў.
У дадатак да інгібіравання можа адбыцца страта цэласнасці мэтавай нуклеінавай кіслаты з-за ўмоў транспарціроўкі і/або захоўвання перад падрыхтоўкай пробы. У прыватнасці, высокія тэмпературы або няправільнае захоўванне могуць прывесці да пашкоджання клетак і нуклеінавых кіслот. Фіксацыя клетак і тканак і ўкладванне ў парафін з'яўляюцца добра вядомымі прычынамі фрагментацыі ДНК і пастаяннай праблемай (гл. малюнкі 1 і 2). У гэтых выпадках не дапаможа нават аптымальная ізаляцыя і ачыстка.

Малюнак 1 | Уплыў імабілізацыі на цэласнасць ДНК
Электрафарэз у агарозным гелі паказаў, што якасць ДНК, вылучанай з парафінавых зрэзаў выкрыццяў, значна адрознівалася. У залежнасці ад спосабу фіксацыі ў экстрактах прысутнічала ДНК рознай сярэдняй даўжыні фрагментаў. ДНК захавалася толькі пры фіксацыі ў натыўных замарожаных узорах і ў буферным нейтральным фармаліне. Выкарыстанне моцнакіслага фіксатара Буэна або небуферного фармаліну, які змяшчае мурашыную кіслату, прывяло да значнай страты ДНК. Астатняя частка моцна фрагментаваная.
Злева даўжыня фрагментаў выражана ў парах кілабаз (кбт)

Малюнак 2 | Страта цэласнасці мішэняў нуклеінавых кіслот
(a) Разрыў 3'-5' на абедзвюх нітках прывядзе да разрыву ў ДНК-мішэні. сінтэз ДНК усё роўна будзе адбывацца на невялікім фрагменце. Аднак, калі на фрагменце ДНК адсутнічае месца адпалу праймера, адбываецца толькі лінейная ампліфікацыя. У найбольш спрыяльным выпадку фрагменты могуць зноў насычаць адзін аднаго, але выхад будзе невялікім і ніжэйшым за ўзровень выяўлення.
(б) Страта падстаў, галоўным чынам з-за дэпурынацыі і адукацыі дымера тымідыну, прыводзіць да памяншэння колькасці Н-сувязяў і памяншэння Tm. Падчас падоўжанай фазы разагрэву праймеры будуць плавіцца з матрычнай ДНК і не будуць адпальвацца нават пры менш строгіх умовах.
(с) Суседнія асновы тыміну ўтвараюць дымер ТТ.
Яшчэ адна распаўсюджаная праблема, якая часта ўзнікае ў малекулярнай дыягностыцы, - гэта менш аптымальнае вызваленне мэтавых нуклеінавых кіслот у параўнанні з экстракцыяй фенолам і хлараформам. У крайніх выпадках гэта можа быць звязана з ілжывымі адмоўнымі вынікамі. Шмат часу можна зэканоміць шляхам кіпячэння лізісу або ферментатыўнага пераварвання рэшткаў клетак, але гэты метад часта прыводзіць да нізкай адчувальнасці ПЦР з-за недастатковага вызвалення нуклеінавых кіслот.

Падаўленне актыўнасці полимеразы ў працэсе ампліфікацыі

Увогуле, інгібіраванне выкарыстоўваецца як паняцце кантэйнера для апісання ўсіх фактараў, якія прыводзяць да неаптымальных вынікаў ПЦР. У строга біяхімічным сэнсе інгібіраванне абмяжоўваецца актыўнасцю фермента, г.зн. яно зніжае або прадухіляе ператварэнне субстрата ў прадукт праз узаемадзеянне з актыўным цэнтрам ДНК-палімеразы або яе кофакторы (напрыклад, Mg2+ для Taq ДНК-палімеразы).
Кампаненты ўзору або розныя буферы і экстракты, якія змяшчаюць рэагенты, могуць непасрэдна інгібіраваць фермент або захопліваць яго кофактары (напрыклад, ЭДТА), тым самым інактывуючы палімеразу і, у сваю чаргу, прыводзячы да зніжэння або ілжываадмоўных вынікаў ПЦР.
Аднак многія ўзаемадзеяння паміж кампанентамі рэакцыі і нуклеінавымі кіслотамі, якія змяшчаюць мішэні, таксама пазначаюцца як «інгібітары ПЦР». Калі цэласнасць клеткі парушаецца ізаляцыяй і вызваляецца нуклеінавая кіслата, можа адбыцца ўзаемадзеянне паміж узорам і навакольным растворам і цвёрдай фазай. Напрыклад, «смяцяры» могуць звязваць адна- або двухцепочечную ДНК шляхам некавалентнага ўзаемадзеяння і перашкаджаць ізаляцыі і ачыстцы, памяншаючы колькасць мішэняў, якія ў канчатковым выніку дасягаюць рэакцыйнага сасуда ПЦР.
У цэлым інгібітары ПЦР прысутнічаюць у большасці вадкасцей арганізма і рэагентаў, якія выкарыстоўваюцца для клінічных дыягнастычных тэстаў (мачавіна ў мачы, гемаглабін і гепарын у крыві), харчовых дабавак (арганічныя кампаненты, глікаген, тлушч, іёны Са2+) і кампанентаў навакольнага асяроддзя (фенолы , цяжкія металы)

Больш распаўсюджаныя інгібітары ПЦР можна знайсці ў бактэрыях і эукарыятычных клетках, немішэневай ДНК, ДНК-звязваючых макрамалекулах тканкавых матрыц і лабараторным абсталяванні, такім як пальчаткі і пластмасы. Ачыстка нуклеінавых кіслот падчас або пасля экстракцыі з'яўляецца пераважным метадам для выдалення інгібітараў ПЦР.
Сёння рознае аўтаматызаванае абсталяванне для экстракцыі можа замяніць многія ручныя пратаколы, але 100% аднаўлення і/або ачысткі мішэняў ніколі не было дасягнута. Патэнцыйныя інгібітары могуць яшчэ прысутнічаць у вычышчаных нуклеінавых кіслотах або ўжо падзейнічаць. Існуюць розныя стратэгіі, каб паменшыць уплыў інгібітараў. Выбар адпаведнай палімеразы можа аказаць істотны ўплыў на актыўнасць інгібітараў. Іншымі праверанымі метадамі зніжэння інгібіравання ПЦР з'яўляюцца павышэнне канцэнтрацыі палімеразы або прымяненне такіх дабавак, як BSA.
Інгібіраванне рэакцый ПЦР можна прадэманстраваць пры дапамозе ўнутранага кантролю якасці працэсу (IPC).
Неабходна старанна выдаліць усе рэагенты і іншыя растворы ў наборы для экстракцыі, такія як этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ізапрапанол і фенол, з изолята нуклеінавай кіслаты шляхам дбайнага прамывання. У залежнасці ад іх канцэнтрацыі яны могуць актываваць або інгібіраваць ПЦР.