Фактары інтэрферэнцыі ў рэакцыях ПЦР

Падчас ПЛР-рэакцыі часта сустракаюцца некаторыя перашкодныя фактары.
З-за вельмі высокай адчувальнасці ПЛР забруджванне лічыцца адным з найважнейшых фактараў, якія ўплываюць на вынікі ПЛР, і можа прывесці да ілжыва станоўчых вынікаў.
Не менш важнымі з'яўляюцца розныя крыніцы, якія прыводзяць да ілжываадмоўных вынікаў. Калі адзін або некалькі важных кампанентаў ПЛР-сумесі або сама рэакцыя ампліфікацыі інгібіруюцца або перашкаджаюць дыягнастычнаму аналізу. Гэта можа прывесці да зніжэння эфектыўнасці і нават да ілжываадмоўных вынікаў.
Акрамя інгібіравання, страта цэласнасці мэтавай нуклеінавай кіслаты можа адбыцца з-за ўмоў транспарціроўкі і/або захоўвання перад падрыхтоўкай узору. У прыватнасці, высокія тэмпературы або недастатковае захоўванне могуць прывесці да пашкоджання клетак і нуклеінавых кіслот. Фіксацыя клетак і тканін, а таксама заліванне ў парафін з'яўляюцца добра вядомымі прычынамі фрагментацыі ДНК і пастаяннай праблемай (гл. малюнкі 1 і 2). У гэтых выпадках нават аптымальнае вылучэнне і ачыстка не дапамогуць.

Малюнак 1 | Уплыў імабілізацыі на цэласнасць ДНК
Электрафарэз у агарозным гелі паказаў, што якасць ДНК, выдзеленай з парафінавых зрэзаў аўтапсій, значна адрознівалася. У экстрактах прысутнічала ДНК рознай сярэдняй даўжыні фрагментаў у залежнасці ад метаду фіксацыі. ДНК захоўвалася толькі пры фіксацыі ў натыўных замарожаных узорах і ў буферным нейтральным фармаліне. Выкарыстанне моцнакіслотнага фіксатара Буэна або небуфераванага фармаліну, які змяшчае мурашыную кіслату, прывяло да значнай страты ДНК. Астатняя фракцыя моцна фрагментаваная.
Злева даўжыня фрагментаў выражана ў кілабазавых парах (кбп)

Малюнак 2 | Страта цэласнасці нуклеінавых кіслот-мішэняў
(a) Разрыў 3′-5′ на абодвух ланцугах прывядзе да разрыву мэтавай ДНК. Сінтэз ДНК усё роўна будзе адбывацца на невялікім фрагменце. Аднак, калі на фрагменце ДНК адсутнічае сайт адпалу праймераў, адбываецца толькі лінейная ампліфікацыя. У найбольш спрыяльным выпадку фрагменты могуць аднаўляць насычэнне адзін аднаго, але выхад будзе малым і ніжэйшым за ўзровень выяўлення.
(b) Страта асноў, галоўным чынам з-за дэпурынацыі і ўтварэння тымідынавага дымера, прыводзіць да змяншэння колькасці вадародных сувязей і зніжэння Tm. Падчас падоўжанай фазы награвання праймеры будуць плавіцца з матрычнай ДНК і не будуць адпальвацца нават пры менш строгіх умовах.
(c) Суседнія тымінавыя асновы ўтвараюць ТТ-дымер.
Яшчэ адна распаўсюджаная праблема, якая часта ўзнікае ў малекулярнай дыягностыцы, — гэта неаптымальнае вызваленне мэтавых нуклеінавых кіслот у параўнанні з фенол-хлараформнай экстракцыяй. У крайніх выпадках гэта можа быць звязана з ілжываадмоўнымі вынікамі. Шмат часу можна зэканоміць, выкарыстоўваючы лізіс кіпячэннем або ферментатыўнае пераварванне клеткавых рэшткаў, але гэты метад часта прыводзіць да нізкай адчувальнасці ПЛР з-за недастатковага вызвалення нуклеінавых кіслот.

Інгібіраванне актыўнасці палімеразы падчас ампліфікацыі

У цэлым, інгібіраванне выкарыстоўваецца як кантэйнернае паняцце для апісання ўсіх фактараў, якія прыводзяць да неаптымальных вынікаў ПЛР. У строга біяхімічным сэнсе інгібіраванне абмежавана актыўнасцю фермента, г.зн. яно зніжае або прадухіляе пераўтварэнне субстрата ў прадукт праз узаемадзеянне з актыўным цэнтрам ДНК-палімеразы або яе кафактарам (напрыклад, Mg2+ для Taq ДНК-палімеразы).
Кампаненты ўзору або розныя буферы і экстракты, якія змяшчаюць рэагенты, могуць непасрэдна інгібіраваць фермент або затрымліваць яго кафактары (напрыклад, ЭДТА), тым самым інактывуючы палімеразу і, у сваю чаргу, прыводзячы да зніжэння або ілжываадмоўных вынікаў ПЛР.
Аднак многія ўзаемадзеянні паміж кампанентамі рэакцыі і нуклеінавымі кіслотамі, якія змяшчаюць мішэні, таксама называюцца «інгібітарамі ПЛР». Пасля таго, як цэласнасць клеткі парушаецца пры выдзяленні і нуклеінавая кіслата вызваляецца, могуць узнікаць узаемадзеянні паміж узорам і навакольным яго растворам і цвёрдай фазай. Напрыклад, «паглынальнікі» могуць звязваць адна- або двухланцуговую ДНК праз некавалентныя ўзаемадзеянні і перашкаджаць выдзяленню і ачыстцы, змяншаючы колькасць мішэняў, якія ў рэшце рэшт дасягаюць рэакцыйнага пасудзіны для ПЛР.
У цэлым, інгібітары ПЛР прысутнічаюць у большасці біялагічных вадкасцей і рэагентаў, якія выкарыстоўваюцца для клінічных дыягнастычных тэстаў (мачавіна ў мачы, гемаглабін і гепарын у крыві), харчовых дабавак (арганічныя кампаненты, глікаген, тлушч, іоны Ca2+) і кампанентаў навакольнага асяроддзя (фенолы, цяжкія металы).

Больш распаўсюджаныя інгібітары ПЛР можна знайсці ў бактэрыях і эўкарыятычных клетках, немішэневай ДНК, макрамалекулах тканевых матрыц, якія звязваюць ДНК, і лабараторным абсталяванні, такім як пальчаткі і пластмасы. Ачыстка нуклеінавых кіслот падчас або пасля экстракцыі з'яўляецца пераважным метадам выдалення інгібітараў ПЛР.
Сёння рознае абсталяванне для аўтаматызаванай экстракцыі можа замяніць многія ручныя пратаколы, але 100% аднаўлення і/або ачысткі мішэняў ніколі не было дасягнута. Патэнцыйныя інгібітары могуць усё яшчэ прысутнічаць у ачышчаных нуклеінавых кіслотах або ўжо маглі пачаць дзейнічаць. Існуюць розныя стратэгіі для зніжэння ўздзеяння інгібітараў. Выбар адпаведнай палімеразы можа аказаць значны ўплыў на актыўнасць інгібітара. Іншымі праверанымі метадамі зніжэння інгібіравання ПЦР з'яўляюцца павелічэнне канцэнтрацыі палімеразы або ўжыванне дабавак, такіх як БСА.
Інгібіраванне рэакцый ПЦР можна прадэманстраваць з дапамогай унутранага кантролю якасці працэсу (ККП).
Неабходна старанна прамыць і выдаліць з ізаляту нуклеінавай кіслаты ўсе рэагенты і іншыя растворы з набору для экстракцыі, такія як этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ізапрапанол і фенол. У залежнасці ад іх канцэнтрацыі яны могуць актываваць або інгібіраваць ПЛР.