Фактары перашкод у рэакцыях ПЦР

Падчас рэакцыі ПЦР часта сустракаюцца некаторыя ўмяшальныя фактары.
З -за вельмі высокай адчувальнасці ПЦР, забруджванне лічыцца адным з найважнейшых фактараў, якія ўплываюць на вынікі ПЦР і могуць прынесці ілжывыя станоўчыя вынікі.
Не менш важныя розныя крыніцы, якія прыводзяць да ілжыва-адмоўных вынікаў. Калі адна або некалькі важных частак ПЦР -сумесі або самой рэакцыі ўзмацнення інгібіруюцца альбо перашкаджаюць, дыягнастычны аналіз можа быць перашкоджаны. Гэта можа прывесці да зніжэння эфектыўнасці і нават ілжывых адмоўных вынікаў.
У дадатак да тармажэння, можа адбыцца страта цэласнасці мэтавай нуклеінавай кіслаты з -за ўмоў дастаўкі і/або захоўвання перад падрыхтоўкай пробы. У прыватнасці, высокія тэмпературы або недастатковае захоўванне могуць прывесці да пашкоджання клетак і нуклеінавых кіслот. Фіксацыя клетак і тканін і ўбудаванне парафіна добра вядомыя прычыны фрагментацыі ДНК і ўстойлівай праблемы (гл. Малюнкі 1 і 2). У гэтых выпадках нават аптымальная ізаляцыя і ачышчэнне не дапамогуць.

Малюнак 1 | Уплыў імабілізацыі на цэласнасць ДНК
Электрафарэз агарозы гель паказаў, што якасць ДНК, выдзеленай з парафінавых аддзелаў выкрыццяў, значна змянялася. ДНК розных сярэдняй даўжыні фрагмента прысутнічала ў экстрактах у залежнасці ад метаду фіксацыі. ДНК захоўвалася толькі тады, калі фіксавалі ў родных замарожаных узорах і ў буферным нейтральным фармаліне. Выкарыстанне моцна кіслых фіксацыйных буйнавых або незабыўных, фармаліну, якая змяшчае форму, прывяло да значнай страты ДНК. Астатняя доля вельмі раздробленая.
Злева даўжыня фрагментаў выражаецца ў парах кілабазы ​​(KBP)

Малюнак 2 | Страта цэласнасці мішэняў нуклеінавай кіслаты
(A) Разрыў 3'-5 'на абедзвюх нітках прывядзе да разрыву мэтавай ДНК. Сінтэз ДНК па -ранейшаму будзе адбывацца на невялікім фрагментах. Аднак, калі на фрагменце ДНК адсутнічае ўчастак для праймера, адбываецца толькі лінейнае ўзмацненне. У самым спрыяльным выпадку фрагменты могуць аднавіць адзін аднаго, але ўраджайнасць будзе невялікі і ніжэйшы ўзровень выяўлення.
(б) Страта падстаў, галоўным чынам з-за дэпурацыі і фарміравання дымера тымідыну, прыводзіць да памяншэння колькасці Н-сувязі і зніжэння ТМ. Падчас выцягнутай фазы пацяплення, праймеры будуць раставаць ад ДНК матрыцы і не будуць адпаліць нават пры менш жорсткіх умовах.
(c) Прылеглыя асновы тыміну ўтвараюць дымер TT.
Яшчэ адна распаўсюджаная праблема, якая часта ўзнікае ў малекулярнай дыягностыцы,-гэта менш аптымальнае вызваленне мэтавых нуклеінавых кіслот у параўнанні з экстракцыяй фенол-хлораформа. У крайнім выпадку гэта можа быць звязана з ілжывымі негатывамі. Шмат часу можна захаваць пры лізісе кіпячэння або ферментатыўнага пераварвання клеткавага смецця, але гэты метад часта прыводзіць да нізкай адчувальнасці да ПЦР з -за недастатковага выкіду нуклеінавай кіслаты.

Інгібіраванне актыўнасці полімеразы падчас ампліфікацыі

Увогуле, тармажэнне выкарыстоўваецца ў якасці канцэпцыі кантэйнера для апісання ўсіх фактараў, якія прыводзяць да неаптымальных вынікаў ПЦР. У строга біяхімічным сэнсе інгібіраванне абмяжоўваецца актыўнасцю фермента, гэта значыць, ён памяншае або прадухіляе пераўтварэнне субстрата-прадукту праз узаемадзеянне з актыўным месцам ДНК-полімеразы або яго кафактарам (напрыклад, Mg2+ для полімеразы Taq DNA).
Кампаненты ў пробе або розныя буферы і экстракты, якія змяшчаюць рэагенты, могуць непасрэдна інгібіраваць фермент або пастнуць яго кафактары (напрыклад, EDTA), тым самым інактываваўшы палімеразку і, у сваю чаргу, прыводзіць да зніжэння або ілжывых адмоўных вынікаў ПЦР.
Аднак многія ўзаемадзеянні паміж кампанентамі рэакцыі і нуклеінавымі кіслотамі, якія змяшчаюць мэтавыя, таксама пазначаныя як "інгібітары ПЦР". Пасля таго, як цэласнасць клеткі парушаецца ізаляцыяй і вылучаецца нуклеінавая кіслата, могуць узнікнуць узаемадзеянне паміж узорам і яго навакольным растворам і цвёрдай фазай. Напрыклад, "Scaveners" могуць звязваць адна- або двухцепочечную ДНК праз невалентныя ўзаемадзеяння і перашкаджаць ізаляцыі і ачышчэнню за кошт памяншэння колькасці мэтаў, якія ў выніку дасягаюць рэакцыйнага посуду ПЦР.
Увогуле, інгібітары ПЦР прысутнічаюць у большасці вадкасцяў і рэагентаў, якія выкарыстоўваюцца для клінічных дыягнастычных выпрабаванняў (мачавіны ў мачы, гемаглабіне і гепарыне ў крыві), харчовыя дабаўкі (арганічныя кампаненты, глікаген, тлушч, іёны Са2+) і кампаненты ў навакольным асяроддзі (фенолы, цяжкія металы))

Больш распаўсюджаныя інгібітары ПЦР можна знайсці ў бактэрыях і эукарыётычных клетках, не мэтавай ДНК, макрамалекул, якія звязваюць ДНК, макрамалекул тканкавых матрыц і лабараторнае абсталяванне, такія як пальчаткі і пластмаса. Ачышчэнне нуклеінавых кіслот падчас або пасля экстракцыі з'яўляецца пераважным метадам выдалення інгібітараў ПЦР.
Сёння розныя аўтаматызаванае абсталяванне для здабычы могуць замяніць мноства ручных пратаколаў, але 100% аднаўлення і/або ачышчэнне мэтаў ніколі не было дасягнута. Патэнцыйныя інгібітары ўсё яшчэ могуць прысутнічаць у вычышчаных нуклеінавых кіслотах альбо, магчыма, ужо ўступілі ў сілу. Існуюць розныя стратэгіі, каб знізіць уздзеянне інгібітараў. Выбар адпаведнай палімеразы можа аказаць значны ўплыў на актыўнасць інгібітараў. Іншыя правераныя метады зніжэння інгібіравання ПЦР - гэта павелічэнне канцэнтрацыі полімеразы або прымяненне дабавак, такіх як BSA.
Інгібіраванне рэакцый ПЦР можа быць прадэманстравана пры дапамозе ўнутранага кантролю якасці працэсу (МПК).
Неабходна сачыць за выдаленнем усіх рэагентаў і іншых раствораў у наборы для экстракцыі, такіх як этанол, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, изопропанол і фенол, з ізаляцыі нуклеінавай кіслаты на дбайнай стадыі прамывання. У залежнасці ад іх канцэнтрацыі яны могуць актываваць або інгібіраваць ПЦР.